Molecular biological pamamaraan sa pananaliksik at ang kanilang paggamit

Molecular biological pamamaraan ng pananaliksik ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa modernong gamot, forensic science, at biology. Salamat sa advances sa pag-aaral ng DNA at RNA, ang tao ay magagawang upang galugarin ang genome ng mga organismo matukoy ang kausatiba ahente, upang makilala ang nais na nucleic acid sa isang halo ng mga acids, atbp

Molecular-biological pamamaraan. Ano ito?

Bumalik sa 70-80s ng mga siyentipiko ay ang unang sa maintindihan genome ng tao. Ang kaganapang ito ay nagbigay sigla sa pag-unlad ng genetic engineering at molecular biology. Pag-aaral ng mga katangian ng DNA at RNA ay sinadya na ito ay posible na ngayon upang gamitin ang mga nucleic acids para sa layunin ng sakit diagnosis, pag-aaral gene.

Paghahanda ng DNA at RNA

Molecular biological diagnostic pamamaraan nangangailangan ng panimulang materyal: kadalas lalabas ang nucleic acid. Mayroong ilang mga paraan upang piliin ang mga sangkap mula sa mga cell ng buhay na organismo. Ang bawat isa ay may pakinabang at disadvantages, at ito ay dapat na isinasaalang-alang kapag ang pagpili ng isang paraan ng paghihiwalay ng nucleic acids sa purong form.

1. Paghahanda ng DNA sa pamamagitan Marmur. Ang pamamaraan ay binubuo sa pagpapagamot ng mga pinaghalong mga sangkap alak, precipitates nagreresulta purong DNA. Ang downside ng ang paraan na ito ay ang paggamit ng kinakaing unti-unti sangkap, penol at kloropormo.

2. Paghihiwalay ng DNA sa boom. Ang pangunahing sangkap na ginamit dito - ay guanidine thiocyanate (GuSCN). Ito nagtataguyod ng pagtitiwalag ng deoxyribonucleic acid sa dalubhasa substrates, mula sa kung saan maaari itong magkakasunod na nakolekta sa pamamagitan ng isang espesyal na buffer. Gayunman GuSCN - ay isang inhibitor ng TCP, at kahit na isang maliit na bahagi na iyon ay makakakuha ideposito sa DNA maaaring maka-impluwensya ang kurso ng polymerase kadena reaksyon, na kung saan ay mahalaga kapag nagtatrabaho sa mga nucleic acids.

3. Presipitasyon ng impurities. Ang pamamaraan ay naiiba mula sa mga nakaraang mga bago sa paraang pinayagan ng mga molecule sa kanilang sarili ay hindi idineposito dehoksiribonukleinovoy acid at impurities. Upang gawin ito, gamitin ang mga ion exchangers. Ang kawalan ay na hindi lahat ng mga sangkap ay maaaring manirahan.

4. Mass screening. Ang pamamaraan na ito ay ginagamit sa mga kaso kung hindi mo na kailangan upang magkaroon ng tumpak na impormasyon tungkol sa istraktura ng DNA Molekyul, at ang pangangailangan upang makakuha ng ilang mga istatistika. Ang dahilan dito ay na ang nucleic acid istraktura ay maaaring napinsala kapag paghawak ng detergents, lalo alkalies.

Pag-uuri ng mga pamamaraan ng pananaliksik

Lahat ng molecular-biological pamamaraan ng pananaliksik ay nahahati sa tatlong pangunahing mga grupo:

1. Amplification (gamit ang isang mayorya ng mga enzymes). Kabilang dito ang PCR - polymerase chain reaction, na kung saan gumaganap ng isang mahalagang papel sa marami sa mga diagnostic pamamaraan.

2. Neamplifikatsionnye. Ang pangkat na ito ng mga pamamaraan ay kaugnay nang direkta sa mga gawain ng nucleic acid mixtures. Mga halimbawa 3 uri blots, sa lugar ng kinaroroonan paghahalo ng lahi, at iba pa

3. Mga Paraan batay sa pagkilala ng signal mula sa probe Molekyul, na kung saan binds sa isang tiyak na DNA o RNA probe. Halimbawa - hybridization sistema Hybride Capture System solusyon (HC2).

Enzymes na maaaring magamit sa molecular biological pamamaraan ng pananaliksik

Maraming molecular diagnostic pamamaraan kasangkot ang paggamit ng malawak na hanay ng mga enzymes. Sa ibaba ay ginagamit pinaka-madalas:

1. paghihigpit enzyme - "cut" ang DNA Molekyul na ang mga kinakailangang mga bahagi.

2. DNA polymerase - synthesizes isang double-maiiwan tayo deoxyribonucleic acid Molekyul.

3. Reverse transcriptase (reverse transcriptase) - ginagamit upang synthesize DNA mula sa isang RNA template.

4. DNA ligase - ay responsable para sa pagbuo ng phosphodiester bono sa pagitan ng nucleotides.

5. exonuclease - nag-aalis ng mga nucleotide mula sa dulo bahagi ng deoxyribonucleic acid Molekyul.

PCR - ang pangunahing pamamaraan ng DNA amplification

Polymerase chain reaction (PCR) ay malawakang ginagamit sa modernong molecular biology. Ang paraan na ito, kung saan ang isang solong DNA Molekyul ay maaaring makuha ng isang mahusay na bilang ng mga kopya (amplifying Molekyul).

Ang pangunahing pag-andar ng PCR:

- diyagnosis ng mga sakit;

- pag-clone ng mga segment ng DNA, Gene.

Upang isagawa ang polymerase chain reaction ay nangangailangan ng mga sumusunod na elemento: paunang DNA Molekyul, ang isang matatag sa init DNA polymerase (Taq o PFU), deoxyribonucleotide phosphates (pinagkukunan ng mga base nitrogen), ang primers (2 primer 1 DNA Molekyul) at mismong isang buffer system na maaaring magsagawa ng lahat ng reaksyon.

PCR ay binubuo ng tatlong hakbang: denaturation, primer pagsusubo at pagpahaba.

1. denaturation. Sa isang temperatura ng 94-95 degrees Celsius proshodit basagin ang mga Bonds ng hydrogen sa pagitan ng dalawang mga kadena ng DNA, at bilang isang resulta makakuha kami ng dalawang single-maiiwan tayo molecules.

2. annealed primers. Sa isang temperatura ng 50-60 degrees tsentigreit nangyayari accession primers sa dulo ng single-maiiwan tayo nucleic acid molecules ayon sa uri ng complementarity.

3. pagpahaba. Sa isang temperatura ng 72 degrees ay synthesized anak na babae double maiiwan tayo deoxyribonucleic acid molecules.

DNA sequencing

Molecular biological pamamaraan ng pananaliksik ay madalas na nangangailangan ng kaalaman ng ang pagkakasunod-sunod ng nucleotides sa isang Molekyul ng deoxyribonucleic acid. Upang matukoy ang genetic code sequenced. Molecular diagnostic ng hinaharap ay batay sa kaalaman nagkamit sa pagpapasiya ng pagkakasunod-sunod ng tao.

Ang mga sumusunod na uri ng sequencing:

• sequencing ng MAXAM-Gilbert;
• Sanger sequencing;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe sequencing.